■ Aonachd òrdugh math: Gun chlaonadh bunaiteach den phròiseas briseadh DNA agus pròiseas leudachaidh PCR.
■ Èifeachdas àrd tionndaidh leabharlainn: faodar togail leabharlann àrd-èifeachdais a dhèanamh cinnteach airson sampallan DNA 1 ng.
■ Obrachadh luath: Chan fheum pròiseas togail an leabharlainn gu lèir ach 2.5 uair a thìde.
■ cosg-èifeachdach: Chan eil feum air ionnstramaidean agus uidheamachd sònraichte。
Seòrsa: Ullachadh leabharlann DNA airson àrd-ùrlar sreath àrd-throughput illumina
Eisimpleir: DNA genomic no criomag mhòr DNA
Targaid: DNA le dà shreath
Cuir a-steach sampall tòiseachaidh: 1 ng- 1 μg
Ùine obrachaidh: 2.5 uair
Tagraidhean sìos an abhainn: Seicheamh air àrd-ùrlar illumina
Faodar na toraidhean gu lèir a ghnàthachadh airson ODM / OEM. Airson mion-fhiosrachadh,cliog air Seirbheis Customized (ODM / OEM)
Cuir a-steach sampall sùbailte agus meud criomagach | Figear 1. Pròifilean criomag DNA de dhiofar ùine ath-bhualadh. Chaidh 10 ng agus 1000 ng DNA a bhriseadh le bhith a ’cleachdadh Kit Leabharlann DNA TIANSeq DirectFast. Chaidh na toraidhean ath-bhualadh a chaidh a làimhseachadh le ùine ath-bhualadh eadar-dhealaichte a ghlanadh le grìogagan magnetach 1.8 × Ampure XP agus air an sgrùdadh le Angilent 2100. |
Còmhdach sìtheachaidh coltach ri Covaris | Figear 2. Coimeas eadar còmhdach genome de dhiofar dhòighean ullachaidh leabharlann. Tha trì DNA genomic bacterial le susbaint GC eadar-dhealaichte measgaichte equimolar, agus chaidh coimeas a dhèanamh eadar toradh còmhdach genome de 100 ng de leabharlannan DNA measgaichte a ’cleachdadh nan dòighean sin. Tha na co-dhùnaidhean a ’sealltainn gu bheil an aon bhuaidh aig Kit Leabharlann TIANSeq DirectFast air briseadh DNA ri rùsgadh meacanaigeach, agus chan eil claonadh bunaiteach ann airson briseadh. |
No Bias siostamach airson cho ìosal ri 1 ng DNA a-steach | Figear 3. Coimeas eadar còmhdach genome de dhiofar dhòighean ullachaidh leabharlann. Tha trì DNA genomic bacterial le susbaint GC eadar-dhealaichte measgaichte equimolar, agus chaidh coimeas a dhèanamh eadar toradh còmhdach genome de 1 ng de leabharlannan DNA measgaichte a ’cleachdadh nan dòighean sin. Tha na co-dhùnaidhean a ’sealltainn gu bheil buaidh criomag cunbhalach aig Kit Leabharlann TIANSeq DirectFast leis an rùsgadh meacanaigeach eadhon airson cuir a-steach DNA cho ìosal ri 1 ng, agus chan eil bias bunasach ann. |
Comasach air sruth-obrach gun PCR | Figear 4. Chaidh diofar chur-a-steach de DNA genomic a chleachdadh gus an leabharlann a thogail le PCR no togail leabharlann gun PCR, agus chaidh toraidhean còmhdach genome a choimeas. Tha na co-dhùnaidhean a ’sealltainn, le obrachadh aon-tiùb agus ceumannan togail leabharlainn èifeachdach, gu bheil an leabharlann DNA a chaidh a thogail le TIANSeq DirectFast Library Kit a’ cumail suas cunbhalachd àrd leis an rùsgadh meacanaigeach ann an cuairteachadh còmhdach sreath criomag airson an dà chuid sruth-obrach beairteachaidh PCR gun PCR. |
Staitistig air Èifeachdas Togail Leabharlann agus Toradh | Figear 5. Toraidhean mion-sgrùdadh cainneachdail air DNA leabharlainn a fhuaireadh le qPCR às deidh togail leabharlann le dòigh gun PCR airson samples le diofar mheudan tòiseachaidh (1, 10, 25, 50, 100, 500,1000 ng). Tha mion-sgrùdadh sreathach ath-tharraingeach a ’sealltainn gu bheil dàimh shreathach mhath aig toradh an leabharlainn ann an raon farsaing de chur-a-steach sampall. Airson cuir a-steach DNA cho ìosal ri 1 ng, chan eil èifeachdas togail leabharlann a ’lùghdachadh. |
Coimeas eadar dàta leanmhainn de dhiofar thoraidhean
Aig an àm seo, tha teicneòlas sreathan àrd-throughput stèidhichte sa mhòr-chuid air teicneòlas sreathan an ath ghinealach. Leis gu bheil fad leughaidh teicneòlas sìtheachaidh an ath ghinealaich cuibhrichte, feumaidh sinn an sreath làn fhaid a bhriseadh sìos gu leabharlannan beaga criomag gus an òrdachadh. A rèir feumalachdan diofar dheuchainnean seicheachaidh, mar as trice bidh sinn a ’taghadh sreath aon-fhillte no sreathan le dà cheann. An-dràsta tha na criomagan DNA de leabharlann sreathan an ath ghinealach air an sgaoileadh anns an raon 200-800 bp.
a) Tha càileachd DNA dona agus tha luchd-dìon ann. Cleachd sampallan DNA àrd-inbhe gus casg a chuir air gnìomhachd enzyme.
b) Chan eil an ìre de shampall DNA gu leòr nuair a thathar a ’cleachdadh dòigh gun PCR gus leabharlann DNA a thogail. Nuair a tha cuir a-steach an DNA sgapte nas àirde na 50 ng, faodar sruth-obrach gun PCR a dhèanamh gu roghnach rè pròiseas togail an leabharlainn. Ma tha an àireamh leth-bhreac den leabharlann ro ìosal airson a leantainn gu dìreach, faodar an leabharlann DNA a mheudachadh le PCR às deidh an ligation adapter.
c) Bidh truailleadh RNA a ’leantainn gu tomhas mearachdach tùsail DNA Faodaidh truailleadh RNA a bhith ann am pròiseas glanaidh DNA genomic, a dh’ fhaodadh leantainn gu tomhas DNA neo-mhearachdach agus gun luchdachadh DNA gu leòr aig àm togail leabharlann. Faodar RNA a thoirt air falbh le bhith a ’làimhseachadh le RNase.
A-1
a) Nochdaidh criomagan beaga (60 bp-120 bp) mar as trice is e criomagan no criathragan atharrachaidh a tha air an cruthachadh le innealan-atharrachaidh. Faodaidh glanadh le grìogagan magnetach Agencourt AMPure XP na mìrean adapter seo a thoirt air falbh gu h-èifeachdach agus dèanamh cinnteach à càileachd sreathan.
b) Bidh criomagan mòra a ’nochdadh anns an leabharlann às deidh leudachadh PCR Meudaichidh meud criomag DNA an leabharlainn le 120 bp às deidh an adapter a leigeil a-steach. Ma tha an criomag DNA a ’dol suas nas motha na 120 bp às deidh ligation an adapter, dh’ fhaodadh seo a bhith air adhbhrachadh le leudachadh criomag neo-àbhaisteach de cus leudachadh PCR. Le bhith a ’lughdachadh na h-àireamh de chearcaill PCR faodaidh e casg a chuir air an t-suidheachadh.
c) Meud neo-àbhaisteach mìrean DNA leabharlainn às deidh ligation adapter Is e fad an inneal-atharrachaidh sa chidsin seo 60 bp. Nuair a tha dà cheann na criomag ceangailte ris na h-innealan-atharrachaidh, cha mheudaich an fhaid ach 120 bp. Nuair a bhios tu a ’cleachdadh inneal-atharrachaidh a bharrachd air an fhear a bheir an t-inneal seo seachad, cuir fios chun t-solaraiche gus fiosrachadh buntainneach a thoirt seachad leithid fad an atharrachaidh. Dèan cinnteach gun lean sruth-obrach agus obrachadh an deuchainn na ceumannan a tha air am mìneachadh san leabhar-làimhe.
d) Meud criomag DNA neo-àbhaisteach ron ligation adapter Is dòcha gu bheil an adhbhar airson an duilgheadas seo air adhbhrachadh le suidheachaidhean ath-bhualadh ceàrr rè briseadh DNA. Bu chòir diofar amannan freagairt a chleachdadh airson diofar chur-a-steach DNA. Ma tha an cur-a-steach DNA nas motha na 10 ng, tha sinn a ’moladh an ùine ath-bhualadh de 12 min a thaghadh mar an ùine tòiseachaidh airson optimization, agus tha meud a’ chriomag a chaidh a thoirt a-mach aig an àm seo sa mhòr-chuid anns an raon 300-500 bp. Faodaidh luchd-cleachdaidh fad mìrean DNA a mheudachadh no a lughdachadh airson 2-4 min a rèir na riatanasan aca fhèin gus na mìrean DNA a mheudachadh leis a ’mheud a tha a dhìth.
A-2
a) Chan eilear a ’dèanamh an ùine as fheàrr ma tha an DNA criomagach ro bheag no ro mhòr, thoir sùil air an Stiùireadh airson Taghadh Ùine Bloigh a tha air a thoirt seachad san stiùireadh gus an ùine ath-bhualadh a dhearbhadh, agus cleachd a’ phuing ùine seo mar smachd, a bharrachd air sin a stèidheachadh siostam ath-bhualadh gus 3 min a leudachadh no a ghiorrachadh gus atharrachadh nas ceart a dhèanamh air ùine briseadh.
A-3
Sgaoileadh meud neo-àbhaisteach de DNA às deidh làimhseachadh criomag
a) Modh leaghaidh ceàrr de dh ’ath-bhualadh criomag, no chan eil an ath-bheachdan air a mheasgachadh gu tur às deidh a leaghadh. Thaw an reagent 5 × Fragmentation Enzyme Mix air deigh. Nuair a tha e air leaghadh, measgaich an ath-fhreagairt gu cothromach le bhith a ’leaghadh gu socair aig bonn an tiùba. Na vortex an reagent!
b) Anns an t-sampall cuir a-steach DNA tha EDTA no truaillearan eile Tha ìsleachadh ianan salainn agus riochdairean chelating ann an ceum glanaidh DNA gu sònraichte cudromach airson soirbheachas na deuchainn. Ma thèid DNA a sgaoileadh ann an 1 × TE, cleachd am modh a tha air a thoirt seachad san stiùireadh gus criomag a dhèanamh. Ma tha dùmhlachd EDTA anns an fhuasgladh mì-chinnteach, thathas a ’moladh an DNA a ghlanadh agus a sgaoileadh ann an uisge deionized airson ath-bhualadh às deidh sin.
c) Tomhas tùsail DNA neo-mhearachdach Tha dlùth cheangal aig meud DNA mìnichte ris an ìre de chur-a-steach DNA. Mus tèid làimhseachadh criomag a dhèanamh, tha tomhas ceart de DNA a ’cleachdadh Qubit, Picogreen agus dòighean eile deatamach gus faighinn a-mach dè an ìre de DNA a th’ anns an t-siostam ath-bhualadh.
d) Chan eil ullachadh an t-siostam ath-bhualadh a ’leantainn an stiùiridh Feumar ullachadh siostam ath-bhualadh measgaichte a dhèanamh air deigh gu teann a rèir an stiùireadh. Gus dèanamh cinnteach à a ’bhuaidh as fheàrr, bu chòir a h-uile pàirt ath-bhualadh a chuir air deigh agus bu chòir an siostam ath-bhualadh ullachadh an dèidh fuarachadh iomlan. Às deidh an ullachadh a bhith air a chrìochnachadh, feuch am piocadh no pìob airson measgachadh gu math. Na bi vortex!
1. Bidh dòigh measgachadh neo-iomchaidh (vortex, oscillation fòirneartach, msaa) ag adhbhrachadh cuairteachadh neo-àbhaisteach de mhìrean leabharlainn (mar a chithear san fhigear a leanas), agus mar sin a ’toirt buaidh air càileachd an leabharlainn. Mar sin, nuair a bhios tu ag ullachadh fuasgladh ath-bhualadh Fragmentation Mix, feuch an cuir thu pìobaireachd gu socair suas is sìos gus measgachadh, no cleachd an corragan gus a phriobadh agus a mheasgachadh gu cothromach. Bi faiceallach nach bi thu a ’measgachadh le vortex.
2. Feumar DNA àrd-ghlan a chleachdadh airson togail leabharlann
■ Ionracas math DNA: Tha an còmhlan electrophoresis nas motha na 30 kb, gun earball
■ OD260 / 230:> 1.5
■ OD260 / 280: 1.7-1.9
3. Feumaidh sùim cur-a-steach DNA a bhith neo-mhearachdach Thathas a ’moladh dòighean Qubit agus PicoGreen a chleachdadh gus tomhas a dhèanamh air DNA, seach Nanodrop.
4. Feumar susbaint EDTA ann am fuasgladh DNA a dhearbhadh Tha buaidh mhòr aig EDTA air an ath-bhualadh criomag. Ma tha susbaint EDTA àrd, feumar glanadh DNA a dhèanamh ron deuchainn às deidh sin.
5. Feumaidh am fuasgladh ath-bhualadh criomag ullachadh air deigh Tha am pròiseas briseadh mothachail air teòthachd agus ùine ath-bhualadh (gu sònraichte às deidh àrdachadh a chuir ris). Gus dèanamh cinnteach gu bheil an ùine freagairt ceart, ullaich siostam freagairt air deigh.
6. Feumaidh an ùine ath-bhualadh criomag a bhith neo-mhearachdach Bheir ùine ath-bhualadh a ’cheum criomag buaidh dhìreach air meud nan toraidhean criomag, agus mar sin a’ toirt buaidh air sgaoileadh meud criomagan DNA anns an leabharlann.
1. Dè an seòrsa sampall a tha buntainneach don phasgan seo?
Faodaidh an seòrsa sampall buntainneach den chit seo a bhith làn RNA no mRNA purraichte le ionracas RNA math. Ma thèid RNA iomlan a chleachdadh gus an leabharlann a thogail, thathas a ’moladh an uidheamachd ìsleachaidh rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) a chleachdadh gus rRNA a thoirt air falbh an toiseach.
2. An urrainnear sampaill FFPE a chleachdadh gus leabharlann a thogail leis an inneal seo?
Bidh an mRNA ann an sampaill FFPE air a lughdachadh gu ìre, le ionracas truagh. Nuair a bhios tu a ’cleachdadh a’ phiseag seo airson togail an leabharlainn, thathas a ’moladh an ùine briseadh a mheudachadh (an ùine criomag a ghiorrachadh no gun a bhith a’ coileanadh criomag).
3. A ’cleachdadh a’ cheum taghadh meud a tha air a thoirt seachad ann an leabhar-làimhe an toraidh, dè a dh ’fhaodadh a bhith ag adhbhrachadh gu bheil an gluasad a-steach a’ nochdadh gluasad beag?
Thèid taghadh meud a dhèanamh a rèir a ’cheum taghadh meud anns an leabhar-làimhe toraidh seo. Ma tha gluasaid ann, is dòcha gur e an adhbhar nach eil na grìogagan magnetach air an cothromachadh gu teòthachd an t-seòmair no nach eil iad làn mheasgaichte, chan eil am pìob-phìob cruinn no tha an leaghan air fhàgail anns a ’ghob. Thathas a ’moladh na molaidhean le adsorption ìosal a chleachdadh airson an deuchainn.
4. Taghadh innealan-atharrachaidh ann an togail leabharlannan
Chan eil reactar adapter anns an inneal togail leabharlann, agus thathas a ’moladh an uidheamachd seo a chleachdadh còmhla ri TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).
5. QC den leabharlann
Dearbhadh cainneachdail leabharlainn: Tha Qubit agus qPCR air an cleachdadh gus dùmhlachd tomad agus dùmhlachd molar an leabharlainn a dhearbhadh. Tha an obrachadh gu tur a rèir leabhar-làimhe an toraidh. Mar as trice coinnichidh dùmhlachd an leabharlainn ri riatanasan sreath GNA. A ’lorg raon sgaoilidh leabharlann: A’ cleachdadh Agilent 2100 Bioanalyzer gus raon cuairteachaidh an leabharlainn a lorg.
6. Taghadh àireamh cearcall leudachaidh
A rèir an stiùireadh, is e an àireamh de chearcaill PCR 6-12, agus bu chòir an àireamh de chearcaill PCR a tha a dhìth a thaghadh a rèir an cur-a-steach sampall. Ann an leabharlannan le toradh àrd, bidh cus leudachaidh mar as trice a ’tachairt ann an diofar ìrean, a tha air a nochdadh le stùc beagan nas motha às deidh stùc an raon targaid ann a bhith a’ lorg Agilent 2100 Bioanalyzer, no tha an dùmhlachd lorg de Qubit nas ìsle na qPCR. Is e rud àbhaisteach a th ’ann an lughdachadh thairis air leudachadh, nach eil a’ toirt buaidh air sreath leabharlannan agus mion-sgrùdadh dàta às deidh sin.
7. Bidh spikes a ’nochdadh ann am pròifil lorg Agilent 2100 Bioanalyzer
Tha coltas spìcean ann an lorg Agilent 2100 Bioanalyzer mar thoradh air briseadh neo-chòmhnard de shamhlaichean, far am bi barrachd chriomagan ann am meud sònraichte, agus bidh seo nas fhollaisiche às deidh beairteachadh PCR. Anns a ’chùis seo, thathas a’ moladh gun a bhith a ’dèanamh an taghadh meud, ie cuir suidheachadh a’ chriomag gu 94 ° C airson guir 15 min, far a bheil cuairteachadh a ’chriomag beag agus dlùth, agus faodar an aon-ghnè a leasachadh.
Bho chaidh a stèidheachadh, tha an fhactaraidh againn air a bhith a ’leasachadh toraidhean den chiad ìre le bhith a’ cumail ris a ’phrionnsapal
de chàileachd an toiseach. Tha na toraidhean againn air cliù air leth fhaighinn anns a ’ghnìomhachas agus luachmhor am measg luchd-ceannach ùr is sean.