2 × Pfu PCR Mix

Teamplaid A-1

■ Anns an teamplaid tha neo-chunbhalachd pròtain no luchd-dìon Taq, msaa. ——Purify teamplaid DNA, cuir às do phròtainean pròtain no thoir air falbh teamplaid DNA le innealan glanaidh.

■ Chan eil dì-ghalarachadh an teamplaid coileanta —— Gu h-iomchaidh ag àrdachadh teòthachd dì-ghalarachadh agus a ’leudachadh ùine dì-ghalarachaidh.

■ Milleadh teamplaid —— Ath-ullaich an teamplaid.

Primer A-2

■ Droch càileachd primers —— Dèan ath-synthesachadh an primer.

. Seachain ioma-reothadh agus leaghadh no cryopreserved 4 ° C fad-ùine.

■ Dealbhadh neo-sheasmhach de phrìomhairean (me chan eil fad primer gu leòr, dimer air a chruthachadh eadar primers, msaa.) - Ath-dhealbhadh primers (seachain cruthachadh primer dimer agus structar àrd-sgoile)

A-3 Mg²⁺dùmhlachd

■ Mg²⁺ dùmhlachd ro ìosal —— Meudaich Mg gu iomchaidh²⁺ dùmhlachd: Optimize an Mg²⁺ dùmhlachd le sreath de ath-bheachdan bho 1 mM gu 3 mM le eadar-ama de 0.5 mM gus an Mg as fheàrr a dhearbhadh²⁺ dùmhlachd airson gach teamplaid agus primer.

A-4 Teòthachd Annealing

■ Bidh an teòthachd àrd annealing a ’toirt buaidh air ceangal primer agus teamplaid. —— Thoir air falbh an teòthachd blàthachaidh agus dèan an staid as fheàrr le caisead 2 ° C.

Ùine leudachaidh A-5

■ Ùine leudachaidh goirid —— Meudaich an ùine leudachaidh.

Phenomena: Bidh sampaill àicheil cuideachd a ’sealltainn na bannan òrdugh targaid.

Truailleadh A-1 de PCR

■ Tar-thruailleadh sreath targaid no toraidhean leudachaidh —— Gu faiceallach gun a bhith a ’pìobadh an sampall anns a bheil sreath targaid anns an sampall àicheil no gan dòrtadh a-mach às an tiùb centrifuge. Bu chòir na h-ath-bheachdan no an uidheamachd a bhith fèin-ghluasadach gus cuir às do dh ’aigéid niuclasach a th’ ann, agus bu chòir truailleadh a bhith ann tro dheuchainnean smachd àicheil.

■ Truailleadh ath-bheachdan ——Cuir na h-ath-bheachdan agus stòr aig teòthachd ìosal.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ dùmhlachd ro ìosal —— Meudaich Mg gu iomchaidh²⁺ dùmhlachd: Optimize an Mg²⁺ dùmhlachd le sreath de ath-bheachdan bho 1 mM gu 3 mM le eadar-ama de 0.5 mM gus an Mg as fheàrr a dhearbhadh²⁺ dùmhlachd airson gach teamplaid agus primer.

■ Dealbhadh primer neo-iomchaidh, agus tha homology aig an t-sreath targaid leis an t-sreath neo-targaid. —— Ath-dhealbhadh primers.

Phenomena: Tha na bannan leudachaidh PCR neo-chunbhalach leis a ’mheud ris a bheil dùil, an dara cuid mòr no beag, no uaireannan bidh an dà chuid bannan leudachaidh sònraichte agus bannan leudachaidh neo-shònraichte a’ tachairt.

Primer A-1

■ Sònrachas primer bochd

—— Ath-dhealbhadh primer.

■ Tha an dùmhlachd primer ro àrd —— Meudaich teothachd an dì-ghalarachadh agus cuir ris an ùine dì-ghalarachadh.

A-2 Mg²⁺ dùmhlachd

■ Am Mg²⁺ tha an dùmhlachd ro àrd —— Lùghdaich gu ceart an dùmhlachd Mg2 +: Optimize an Mg²⁺ dùmhlachd le sreath de ath-bheachdan bho 1 mM gu 3 mM le eadar-ama de 0.5 mM gus an Mg as fheàrr a dhearbhadh²⁺ dùmhlachd airson gach teamplaid agus primer.

A-3 Polymerase thermostable

■ Meud cus enzyme —— Thoir air falbh suim enzyme gu h-iomchaidh aig amannan 0.5 U.

A-4 Teòthachd Annealing

■ Tha an teòthachd annealing ro ìosal —— Gu h-iomchaidh àrdaich an teòthachd blàthachaidh no gabh ris an dòigh annealing dà ìre

Cearcaill A-5 PCR

■ Cus de chearcaill PCR —— Lùghdaich an àireamh de chearcaill PCR.

Primer A-1—— Sònrachas sònraichte —— Ath-dhealbhaich an primer, atharraich suidheachadh agus fad a ’phrìomhaire gus a shònrachas a neartachadh; no a ’dèanamh PCR neadaichte.

Teamplaid A-2 DNA

—— Chan eil an teamplaid fìor-ghlan ——Purify an teamplaid no tarraing DNA le pasgain glanaidh.

A-3 Mg²⁺ dùmhlachd

——Mg²⁺ dùmhlachd ro àrd —— Lùghdaich Mg gu ceart²⁺ dùmhlachd: Optimize an Mg²⁺ dùmhlachd le sreath de ath-bheachdan bho 1 mM gu 3 mM le eadar-ama de 0.5 mM gus an Mg as fheàrr a dhearbhadh²⁺ dùmhlachd airson gach teamplaid agus primer.

A-4 dNTP

——Tha dùmhlachd dNTPs ro àrd —— Thoir air falbh dùmhlachd dNTP gu h-iomchaidh

A-5 Teòthachd Annealing

——Tha teòthachd blàthachaidh ìosal —— Gu h-iomchaidh àrdaich an teòthachd blàthachaidh

Cearcaill A-6

——To iomadh cearcall —— Dèan lùghdachadh air an àireamh rothaireachd

Is e a ’chiad cheum am polymerase iomchaidh a thaghadh. Chan urrainnear Taq polymerase cunbhalach a dhearbhadh air sgàth dìth gnìomhachd ro-sgaoileadh 3’-5 ’, agus bidh mì-chothromachadh a’ lughdachadh èifeachdas leudachaidh criomagan gu mòr. Mar sin, chan urrainn dha Taq polymerase cunbhalach leudachadh a dhèanamh air mìrean targaid nas motha na 5 kb. Bu chòir Taq polymerase le atharrachadh sònraichte no polymerase fidelity àrd eile a thaghadh gus èifeachdas leudachaidh a leasachadh agus coinneachadh ri feumalachdan leudachadh criomag fada. A bharrachd air an sin, tha leudachadh air criomagan fada cuideachd ag iarraidh atharrachadh co-fhreagarrach air dealbhadh primer, ùine denaturation, ùine leudachaidh, pH bufair, msaa. Mar as trice, faodaidh primers le 18-24 bp toradh nas fheàrr a thoirt seachad. Gus casg a chuir air milleadh teamplaid, bu chòir an ùine dì-ghalarachaidh aig 94 ° C a lùghdachadh gu 30 diog no nas lugha gach cearcall, agus bu chòir an ùine airson teòthachd àrdachadh gu 94 ° C mus tèid an leudachadh a dhèanamh nas lugha na 1 min. A bharrachd air an sin, le bhith a ’suidheachadh teothachd an leudachaidh aig timcheall air 68 ° C agus a’ dealbhadh na h-ùine leudachaidh a rèir ìre 1 kb / min faodaidh sin dèanamh cinnteach gu bheil leudachadh èifeachdach air criomagan fada.

Faodar an ìre mearachd de leudachadh PCR a lùghdachadh le bhith a ’cleachdadh diofar polymerases DNA le fìor dhìlseachd. Am measg a h-uile polymeras DNA Taq a chaidh a lorg gu ruige seo, tha an ìre mearachd as ìsle agus an dìlseachd as àirde aig Pfu enzyme (faic an clàr ceangailte). A bharrachd air taghadh enzyman, faodaidh luchd-rannsachaidh ìre mùthaidh PCR a lughdachadh tuilleadh le bhith a ’dèanamh an fheum as fheàrr de shuidheachaidhean ath-bhualadh, a’ gabhail a-steach dèanamh suas bufair, dùmhlachd de polymerase thermostable agus a ’dèanamh an fheum as fheàrr de chearcall PCR.