FastKing gDNA A ’riarachadh RT SuperMix

Tha RNA A-1 air a lughdachadh

——Purify RNA àrd-chàileachd gun truailleadh. Bu chòir an stuth bhon tèid RNA a thoirt a-mach a bhith cho ùr ‘s as urrainn gus casg a chuir air truailleadh RNA. Dèan sgrùdadh air ionracas RNA air gel dì-ghalaichte ro ath-bhualadh RT. Às deidh às-tharraing RNA, bu chòir a stòradh ann an 100% formamide. Ma thèid inhibitor RNase a chleachdadh, bu chòir an teòthachd teasachaidh a bhith <45 ° C, agus bu chòir gum biodh am pH nas ìsle na 8.0, air dhòigh eile leigidh an inhibitor a-mach gach RNase ceangailte. A bharrachd air an sin, bu chòir inhibitor RNase a chur ris ann am fuasglaidhean anns a bheil ≥ 0.8 mM DTT.

Tha RNA A-2 a ’toirt a-steach luchd-bacadh ath-bheachdan ath-sgrìobhaidh cùil

—— Tha luchd-dìon ath-sgrìobhaidh cas a ’toirt a-steach SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, salann guanidine, msaa. Measgaich an RNA smachd leis an sampall, agus dèan coimeas eadar an toradh agus an ath-bhualadh RNA smachd gus faighinn a-mach a bheil inhibitor ann. Nigh frasadh RNA le 70% (v / v) ethanol gus luchd-dìon a thoirt air falbh.

A-3 Annealing gu leòr de primers a chaidh a chleachdadh airson a ’chiad shreath de cDNA a shintheachadh

—— Dèan cinnteach gu bheil an teòthachd blàthachaidh freagarrach airson na prìomhairean a chaidh a chleachdadh san deuchainn. Airson hexamers air thuaiream, thathas a ’moladh an teòthachd a chumail aig 25 ° C airson 10 min mus ruig thu an teòthachd ath-bhualadh. Airson primers sònraichte gine (GSP), feuch GSP eile, no gluais gu oligo (dT) no hexamer air thuaiream.

A-4 Meud beag de RNA tòiseachaidh

—— Cuir a-steach na tha de RNA. Airson sampaill RNA nas lugha na 50 ng, faodar 0.1 μg gu 0.5 μg acetyl BSA a chleachdadh anns a ’chiad shreath cDNA synthesis

A-5 Chan eil an sreath targaid air a chuir an cèill anns na figheagan sgrùdaichte.

——Tha figheagan eile.

Bidh freagairt A-6 PCR a ’fàilligeadh

—— Airson RT-PCR dà-cheum, chan urrainn don teamplaid cDNA sa cheum PCR a bhith nas àirde na 1/5 den tomhas ath-bhualadh.

A-1 Annealing neo-shònraichte de primers agus teamplaidean

—— Cha bu chòir 2-3 dG no dC a bhith ann an 3'-deireadh primers. Cleachd primers sònraichte Gene anns a ’chiad synthesis de shreath an àite primers air thuaiream no oligo (dT). Cleachd teòthachd annealing nas àirde anns a ’chiad beagan chearcaill, agus an uairsin teothachd nas ìsle. Cleachd polymerase Taq DNA teth-tòiseachaidh airson PCR gus sònrachas na h-ath-bhualadh a leasachadh.

A-2 Dealbhadh dona de phrìomhairean sònraichte gine

—— Lean na h-aon phrionnsapalan airson dealbhadh primer leudachaidh.

RNA A-3 air a thruailleadh le DNA genomic

——Treat RNA le ìre PCR DNase I. Stèidhich ath-bhualadh smachd gun ath-sgrìobhadh air ais gus truailleadh DNA a lorg.

A-4 A ’cruthachadh dimer primer

——Deasaich primers gun sreathan taiceil aig deireadh 3 '.

A-5 Too àrd Mg²⁺ dùmhlachd

—— Dèan àrdachadh air Mg²⁺ dùmhlachd airson gach teamplaid agus measgachadh primer

A-6 Truailleadh le DNA cèin

—— Cleachd molaidhean a tha an aghaidh aerosol agus enzymes UDG.

A-1 Tha susbaint a ’chiad toradh dualach ro àrd

—— Thoir air ais meud a 'chiad toradh dualach sa cheum ath-bhualadh gnàthach PCR.

A-2 Suim primer ro àrd ann an ath-bhualadh PCR

—— Thoir air falbh cuir a-steach primer.

A-3 Cus chearcallan

—— Dèan gnàthachadh air suidheachaidhean freagairt PCR agus lughdaich àireamh cearcall PCR.

A-4 Teodhachd teannachaidh ro ìosal

—— Cuir a-steach teòthachd blàthachaidh gus casg a chuir air tòiseachadh agus leudachadh neo-shònraichte.

A-5 Meudachadh neo-shònraichte air mìrean oligonucleotide air an gineadh le truailleadh DNase ann an DNA —— Thoir air falbh RNA àrd-inbhe gus casg a chuir air truailleadh DNA.

Tha RT-PCR gus RNA ath-sgrìobhadh a thionndadh gu cDNA, agus an uairsin an cDNA ath-sgrìobhadh ath-sgrìobhadh a chleachdadh mar theamplaid airson freagairt PCR gus an criomag targaid a mheudachadh. Tagh an dàrna cuid primers air thuaiream, Oligo dT agus primers sònraichte gine a rèir cumhachan sònraichte an deuchainn. Faodar na primers gu h-àrd a chleachdadh airson mRNA cealla eukaryotic goirid gun structar hairpin.

Random primer: Freagarrach airson RNA fada le structar hairpin, a bharrachd air a h-uile seòrsa RNA leithid rRNA, mRNA, tRNA, msaa. Tha iad air an cleachdadh sa mhòr-chuid airson ath-bhualadh RT-PCR de aon teamplaid.

Oligo dT: Freagarrach airson RNA le earball PolyA (chan eil earbaill PolyA aig RNA prokaryotic, Oligo dT rRNA eukaryotic agus tRNA). Leis gu bheil Oligo dT ceangailte ri earball PolyA, feumar càileachd sampallan RNA a bhith àrd, agus bidh eadhon beagan truailleadh a ’lughdachadh gu mòr an ìre de synthesis cDNA làn-fhad.

Primer sònraichte do ghine: A ’cur ri sreath an teamplaid, freagarrach airson suidheachaidhean far a bheil an sreath targaid aithnichte.

Tha dà dhòigh ann:

1. Modh iomraidh taobh a-staigh: Ann an teòiridh, tha cDNA na mhìrean DNA de dhiofar fhaid, agus mar sin tha toradh electrophoresis smear. Ma tha pailteas RNA ìosal, cha nochd toradh sam bith ann an electrophoresis, ach chan eil seo a ’ciallachadh nach tèid toradh a mheudachadh le PCR. San fharsaingeachd, faodar iomradh a-staigh a chleachdadh gus cDNA a lorg. Ma tha toraidhean aig an iomradh a-staigh, faodar càileachd cDNA a ghealltainn gu bunaiteach (ann am beagan chùisean, ma tha an criomag gine targaid ro fhada, dh ’fhaodadh gum bi eisgeachdan ann).

2. Ma tha gine aithnichte air a leudachadh leis an teamplaid seo, faodar a dhearbhadh le prìomhairean a ’ghine seo. Chan eil leudachadh air iomradh a-staigh gu riatanach a ’ciallachadh nach eil duilgheadas ann le cDNA. Leis gu bheil pailteas iomraidh taobh a-staigh cDNA, tha e furasta a mheudachadh. Ma tha cDNA air a lughdachadh gu ìre airson diofar adhbharan, bho shealladh coltachd, thèid buaidh mhòr a thoirt air toraidhean PCR de ghinean targaid pailteas ìosal. Ged a tha iomradh a-staigh fhathast àrd ann am pailteas, is dòcha nach toir seo buaidh air an leudachadh.

Degrade gu ìre de RNA. Lorg ionracas agus glanadh RNA

Faodaidh susbaint RNA de dhiofar ghnèithean a bhith eadar-dhealaichte, ach san fharsaingeachd, bu chòir dà bhann soilleir 28S agus 18S a bhith anns an RNA iomlan a chaidh a thoirt a-mach ann an electrophoresis gel, agus bu chòir soilleireachd a ’chòmhlain a bh’ ann a bhith dà uair cho àrd ris an fhear mu dheireadh. Tha an còmhlan 5S a ’nochdadh gu bheil RNA air a dhol bhuaithe, agus tha a shoilleireachd co-rèireach ris an ìre truaillidh. Chan eil leudachadh soirbheachail air iomradh a-staigh a ’ciallachadh nach eil duilgheadas ann le RNA, seach gu bheil an t-iomradh a-staigh ann am pailteas àrd, faodar RNA a mheudachadh fhad‘ s nach eil an crìonadh cruaidh. An OD₂₆₀/ OD₂₈₀bu chòir co-mheas de RNA fìor-ghlan air a thomhas le spectrophotometer a bhith eadar 1.9 agus 2.1. Bidh beagan beag de phròtain ann an RNA a ’lughdachadh a’ cho-mheas. Cho fad ‘s nach eil an luach ro ìosal, cha toir seo buaidh air RT. Is e ionracas RNA an rud as cudromaiche airson RT.

Chan urrainn do leudachadh a ’ghine iomraidh a-staigh ach sealltainn gu bheil RT air soirbheachadh, ach chan eil e gu riatanach co-cheangailte ri càileachd an dual cDNA. Leis gu bheil na criomagan iomraidh a-staigh sa chumantas beag ann am meud agus àrd ann an abairt, tha iad nas fhasa a bhith soirbheachail ann an ath-sgrìobhadh cùil. Ach, tha meud agus faireachdainn gine targaid ag atharrachadh bho ghine gu gine. Chan urrainnear càileachd cDNA a bhreithneachadh ach le iomradh a-staigh gu sònraichte airson na criomagan targaid nas fhaide na 2 kb.

Tha structaran àrd-sgoile iom-fhillte aig cuid de shamhlaichean, no tha susbaint GC beairteach aca, no tha iad luachmhor le pailteas ìosal. Anns na cùisean sin, bu chòir reverse transcriptase iomchaidh a thaghadh a rèir meud a ’chriomag targaid agus an sampall. Airson teamplaidean RNA le susbaint àrd GC agus structar àrd-sgoile iom-fhillte, tha e duilich an structar àrd-sgoile fhosgladh aig teòthachd ìosal, no le reverse transcriptase cumanta. Airson na teamplaidean sin, faodar Quant Reverse Transcriptase a thaghadh, oir tha e follaiseach gu bheil a choileanadh ath-sgrìobhaidh cùil nas fheàrr na coileanadh sreath M-MLV reverse transcriptase, a dh ’fhaodas ath-sgrìobhadh a dhèanamh air grunn theamplaidean RNA gu h-èifeachdach agus RNA ath-sgrìobhadh gu cDNA a’ chiad shreath chun na h-ìre as motha. Nuair a bhios tu a ’cleachdadh cidsin transversease transcriptase coitcheann, chan urrainn do shiostam 20 μl ach ath-sgrìobhadh 1 μg de RNA iomlan a thionndadh air ais. Feuch an toir thu aire don chomas RT as àirde. Ma thèid cus a dhèanamh den teamplaid, bidh ath-sgrìobhadh cùil a ’fàbharachadh an RNA le pailteas àrd. Mar sin, tha e nas fheàrr gun a bhith nas àirde na an comas as motha san t-siostam.

A-1 Obraich a-mach a bheil RNA air a dhroch mhilleadh agus a bheil RT soirbheachail

San fharsaingeachd, tha an adhbhar airson fàilligeadh leudachadh iomraidh a-staigh gu tric air adhbhrachadh le droch mhilleadh RNA. Is e adhbhar eile a dh ’fhaodadh fàiligeadh ath-sgrìobhadh cùil. Chan urrainnear iomradh a-staigh a chleachdadh mar inbhe gus breithneachadh a dhèanamh air càileachd aon shreath cDNA, ach faodar a chleachdadh mar shlat-tomhais gus breithneachadh a bheil ath-sgrìobhadh cùil soirbheachail mura h-eil duilgheadas ann de chàileachd RNA. Is e an rud as cudromaiche sa phròiseas ath-sgrìobhaidh cùil a bhith a ’cumail suas teòthachd seasmhach agus siostam ath-bhualadh seasmhach gus èifeachdas ath-bhualadh a leasachadh.

A-2 Obraich a-mach a bheil na prìomhairean airson leudachadh genes iomraidh earbsach agus a bheil duilgheadasan ann le ath-bheachdan air an cleachdadh ann am PCR.

Airson tomhas coimeasach, feumar RNA a thomhas mus tèid ath-sgrìobhadh a thionndadh, a tha cuideachd riatanach ann an iomadh inneal tar-sgrìobhaidh cùil, mar eisimpleir, tomhas cuir a-steach RNA mar 1 μg. Leis gur e fuasgladh measgaichte a th ’anns a’ chùl cDNA ath-sgrìobhte, a ’toirt a-steach RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, agus eadhon beagan fuigheall DNA, thèid gluasaid adhbhrachadh, agus mar sin tha e do-dhèanta an cDNA a thomhas gu ceart. Mar sin, tha feum air tomhas RNA. A ’beachdachadh air èifeachdas ath-sgrìobhaidh cùil an aon rud am measg diofar shamhlaichean, bu chòir an ìre de cDNA a gheibhear a bhith co-ionann, agus faodaidh an anailis cainneachdail coimeas a dhèanamh eadar ìrean faireachdainn de dhiofar ghinean anns an aon uiread de RNA iomlan. Nuair a bhios tu a ’coileanadh PCR cainneachdail fluorescence coimeasach, is dòcha nach bi feum air cDNA cainneachdail às deidh ath-sgrìobhadh air ais oir is urrainnear an gine iomraidh a-staigh a chleachdadh mar iomradh.

Tha e gu ìre mhòr co-cheangailte ris na ginean, agus chan eil ath-sgrìobhadh cùil de chriomag fhada ion-dhèanta airson a ’mhòr-chuid de ghinean. An toiseach, tha èifeachdas tar-sgrìobhadh cùil fada nas ìsle na èifeachdas PCR. San dàrna àite, tha roinn beairteach GC agus structar àrd-sgoile mòran de ghinean a ’cuingealachadh an dà chuid ath-sgrìobhadh cùil agus PCR. Mu dheireadh, tha e duilich a bhith a ’gealltainn èifeachdas dìlseachd agus meudachaidh PCR aig an aon àm. Ann am pròiseas ath-sgrìobhadh cùil, chan urrainn dha duine gealltainn gum faigh iad criomag fhada airson gineachan leth-bhreac, gu sònraichte a ’cleachdadh oligo dT. A thaobh 5 'UTR le barrachd GC, tha e eadhon nas duilghe. Mar sin, tha e fhathast na dhòigh reusanta air tar-sgrìobhadh a thionndadh air ais le primers air thuaiream, lorg na làraich cleavage nàdarra anns a ’chriomag targaid, leudachadh le earrannan, agus an uairsin a’ coileanadh a ’chladhach cuibhreachaidh agus ligation. San fharsaingeachd, tha e duilich leudachadh a dhèanamh air mìrean nas motha na 2 kb, ach chan eil e an-còmhnaidh do-dhèanta faighinn: 1.First of all, gealltainn ionracas RNA / mRNA, agus is fheàrr às-tharraing TRIZOL. Faodar cromag 2.M-MLV RT-PCR a chleachdadh gu dìreach. Leudaich ùine annealing agus àrdaich àireamh rothaireachd sa phròiseas leudachaidh gu ceart. Air an làimh eile, faodar PCR neadaichte a chuir an sàs, no ath-bhualadh aon no dhà a dhèanamh an toiseach le dì-ghalarachadh leudaichte agus ùine leudachaidh ro leudachadh PCR àbhaisteach, a dh ’fhaodadh cuideachadh le bhith a’ leudachadh chriomagan. Thoir aire do dhìlseachd an polymerase. Faodar 3.Long Taq a chleachdadh ann am PCR gus toraidhean air leth fhaighinn. Iarrtas abairt pròtain 4.For, bu chòir polymerase fidelity àrd a chuir an sàs.

Tha dà sheòrsa de transverse transcriptase air an tabhann le TIANGEN: Quant / King RTase agus TIANScript M-MLV. Is e am prìomh eadar-dhealachadh eatarra meud teamplaidean a-steach. Tha Quant na thionndadh transcriptase air leth, a tha eadar-dhealaichte bhon M-MLV a thathas a ’cleachdadh gu cumanta a’ tighinn bho bhìoras leucemia Moloney murine. Tha Quant na transversease reverse àrd-èifeachdais ùr air a chuir an cèill le innleadaireachd Escherichia coli. Tha Quant freagarrach airson leudachadh air 50 ng-2 μg de RNA le gnìomhachd tar-sgrìobhaidh àrd cùil agus toradh àrd. An coimeas ri MMLV no AMV àbhaisteach, is e an fheart as motha aig Quant gu bheil dàimh làidir aige ri teamplaidean RNA agus gun urrainn dhaibh teamplaidean iom-fhillte ath-sgrìobhadh a thionndadh air ais gun dì-ghalarachadh teòthachd àrd. Airson teamplaidean le susbaint GC nas àirde, tha an èifeachdas cùil nas àirde. Ach, tha gnìomhachd RNase H aig an reverse transcriptase seo, a dh ’fhaodadh buaidh a thoirt air fad toradh cDNA (freagarrach airson teamplaidean <4.5 kb). Airson ath-sgrìobhadh gnàthach cas, thathas a ’moladh TIANScript MMLV reverse transcriptase. Tha an RTase seo na enzyme atharraichte le gnìomhachd RNase H gu math lag, a tha freagarrach airson synthesis cDNA fada (> 5 kb).

Tha tar-sgrìobhadh cùil aon-cheum agus leudachadh PCR air a chrìochnachadh san aon phìob gun a bhith a ’fosgladh còmhdach an tiùba eadar synthesis cDNA agus leudachadh, a tha cuideachail gus truailleadh a lughdachadh. Leis gu bheil a h-uile sampall cDNA a fhuaireadh air a chleachdadh airson leudachadh, tha an cugallachd nas àirde, le 0.01 cg aig a ’char as lugha de RNA iomlan. Airson RTPCR aon-cheum soirbheachail, bidh primers sònraichte gine air an cleachdadh mar as trice gus synthesis cDNA a thòiseachadh. Tha an dòigh dà-cheum, is e sin ath-sgrìobhadh cùil agus leudachadh PCR air a dhèanamh ann an dà cheum. An toiseach tha tar-sgrìobhadh cùil air a dhèanamh bho theamplaid RNA gus cDNA fhaighinn, agus tha an cDNA a chaidh fhaighinn a ’tighinn fo smachd aon no barrachd ath-bheachdan PCR. Faodaidh an dòigh dà-cheum oligo (dT) no primers air thuaiream a chleachdadh gus synthesis a ’chiad shreath de cDNA a stiùireadh, agus faodaidh e ath-sgrìobhadh a dhèanamh air gach fiosrachadh mRNA bho shampall sònraichte.